منابع و ماخذ پایان نامه ويروس، سانتي، نگهداري

50 درصدي در جلوگيري از رشد ويروس از خود نشان داد(50).
در سال 2009،Orhan و همکارانش از چندين گونه گياهي و از جمله مرزه استفاده کردند تا اثرات آنتي وايرال آنها را برويرس HSVI و پاراآنفولانزا تيپ3 بررسي کنند براي اين منطور از رده ي سلولي Vero استفاده کردند که نتايج حاصل از اين تحقيق نشان داد گياه مرزه اثرات ضد ويروسي مناسبي بر عليه هر دو ويروس نام برده از خود نشان داده است(30) .
در سال 2012، Saab و همکاران از عصاره اتانولي 8 گونه گياه در مقابل ويروس هرپس سيمپلکس تيپ يک استفاده کردند که اکثر آنها از خانواده نعنائيان و يک گونه از آنها مرزهTymbra بود. در اين آزمايش از قسمت هاي هوايي و گل ها و برگهاي گياهان استفاده شد. رده سلولي Vero و روش سنجش سايتوتوکسيسيتي MTT بود. که از بين گياهان مورد آزمايش، گياه مرزه Tymbra فعاليت بازدارندگي قابل قبول و بيشتري را از خود نشان داد(69)
فصل سوم
مواد و روش ها
3-1 وسايل و دستگاه هاي عمومي مورد نياز براي آزمايشگاه کشت سلول:
ميکروسکوپ اينورت
ميکروب نوري معمولي
لام نئوبار
ترازوي حساس
هود بيولوژيک
دستگاه الايزا Reader
دستگاه pH متر
ورتکس
تانک هاي ازت مايع
بن ماري
فور
اتوکلاو
فريزرهاي 20- و 70- درجه سانتي گراد
انکوباتور CO2 و معمولي
سمپلر هاي متغير و ثابت و راکهاي مخصوص سر سمپلر
سانتريفوژ معمولي و يخچال دار
لوله هاي آزمايش در پيچ دار و معمولي
پيپت مدرج و پيپت پاستور
ظروف شيشه اي از جمله: ارلن، بشر، استوانه ي مدرج و …
ميکروتيوب 5/0، 5/1، 2 ميلي ليتر
سرنگ ml50 و ml20
ظروف مخصوص کشت سلول در اندازه هاي مختلف شامل فلاسک ها و ميکروپليت
فيلتر 22/0 ميکرون
انواع لوازم شيشه اي مخصوص نگهداري محيط، سرم و تريپسين
شيکر
همزن مغناطيسي
3-2 مواد مورد نياز براي کشت سلول:
رده سلولي Hela
سرم جنين گاو (FBS) Fetal Bovine Serum
محيط کشت (DMEM) Dulbecco,s Modified Essential Medium
آنتي بيوتيک هاي استرپتومايسين و پني سيلين
محلول تريپسين- ورسن ( Trypsin-Versen)
بي کربنات سديم
آب مقطر ديونيزه
دي متيل سولفوکسايد (DMSO)
محلول PBS بدون کلسيم و منيزيم Calcium Magnesium Free- Phosphate Baffered Saline
3-3 آماده کردن محيط هاي کشت سلول:
براي انجام کشت سلول در خارج از بدن موجود زنده بايد شرايطي را فراهم آورد که به خصوصيات داخلي
بدن موجود زنده بسيار تشابه داشته باشد. براي فراهم نمودن اين شرايط از محيط هاي کشت سلول استفاده مي شود که تامين کننده مواد غذايي مورد نياز سلول از جمله اسيد هاي آمينه، نمک ها، فسفات ها، مواد قندي و بنا به ضرورت مواد رنگي خنثي به عنوان معرف. در اين پژوهش از محيط هاي DMEM شرکت Biosera استفاده گرديد.
3-4 تهيه محيط کشت:
مهم ترين مواد لازم جهت تهيه يک ليتر محيط کشت سلولDMEM عبارتند از:
پودر محيط کشت DMEM 4/13 گرم
آنتي بيوتيک پني سيلين unit/ml100
آنتي بيوتيک استرپتومايسين µg/ml 100
ال گلوتامين 3/0 گرم
بي کربنات سديم 7/3 گرم
آب ديونيزه تا حجم يک ليتر
پس از تهيه محيط کشت بايد pH محيط را به ميزان مطلوب (7- 8/6) تنظيم نمود که براي اين منظور از NaOH يک مولار و اسيد کلريدريک يک مولار استفاده مي شود. از آنجايي که محيط کشت سلول منبع غني از مواد مغذي و مستعد براي رشد باکتريها مي باشد، استفاده از آنتي بيوتيک هاي وسيع الطيف نظير استرپتومايسين و پني سيلين الزامي مي باشد.
3-5 استريليزاسيون محيط کشت سلول:
پس از آماده سازي و تنظيم pH محيط کشت و افزودن آنتي بيوتيک هاي مورد نياز به آن، به وسيله فيلتر 22/0 ميکرون و سرنگ استريل شد. جهت اطمينان از عدم وجود آلودگي احتمالي در محيط، نمونه اي از آن
در ميکروتيوب استريل براي بررسي رشد ميکروارگانيسم ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتي گراد قرار داده و بقيه محيط در ظروف درپيچ دار استريل در 4درجه سانتي گراد نگهداري شد.
چون ال- گلوتامين و آنتي بيوتيک ها نيمه عمر کوتاهي در دماي 37 درجه سانتي گراد دارند و همچنين به دليل احتمال آلودگي در دماي 37درجه سانتي گراد نگهداري محيط کشت در يخچال الزامي است.
3-6 آماده سازي و افزودن سرم:
در اين پژوهش از سرم جنين گاو (Biosera) استفاده شد. براي غير فعال کردن کمپلمان موجود در آن، سرم را در بن ماري دماي 56 درجه سانتي گراد به مدت 30 دقيقه حرارت داده شد و سپس زير هود به لوله هاي استريل انتقال داده شد و تا زمان مصرف در فريزر 20- درجه سانتي گراد نگهداري شد. نقش سرم در محيط کشت تامين فاکتورهاي رشد، هورمون ها و برخي اسيد آمينه ها و پيش ساز هاي اسيد نوکلئيک و اسيد چرب مي باشد.
3-7 روش تهيه PBS بدون کلسيم و منيزيم:
از اين محلول عموما به عنوان بافر براي شستشوي سلول ها استفاده مي شود. وجود نمک ها سبب تثبيت فشار اسمزي سلول ها شده و از ليز شدن آنها در زمان شستشو ممانعت مي نمايد. اين محلول طبق فرمول زير ساخته مي شود:
NaCl2 8 گرم
KCl 2/0گرم
Na2HPO4 15/1 گرم
KH2PO4 2/0گرم
آب مقطر ديونيزه 1000 ميلي ليتر
نمک ها را در آب حل کرده، پس از تنظيم pH (7 – 3 ) حجم نهايي را به يک ليتر رسانده با اتوکلاو استريل کرده، در 4 درجه سانتي گراد نگهداري مي شود.
3-8 محلول تريپسين- ورسن:
در اين پژوهش از محلول تريپسين- ورسن براي جدا کردن سلول هاي متصل به کف پليت استفاده شد. وجود کلسيم و منيزيم نقش مهمي در اتصال سلول هاي در حال تکثير به سطح فلا سک دارند براي حذف اين دو عنصر از محيط کشت سلول و جدا شدن بهتر سلول ها وجود EDTA در محلول تريپسين کمک قابل توجهي مي کند. تريپسين يکي از اعضاي خانواده اندوپپتيدازها مي باشد و مي تواند باقيمانده آرژنين و ليزين را هيدروليز کند. اين مواد به صورت آماده در قالب تجاري 100X(Biosera) تهيه شد و چون محلول به صورت 1X استفاده مي شود آنرا در PBS رقيق کرده و سپس در حجم هاي 10 ميلي ليتر تقسيم و به صورت استريل در فريزر 20- درجه سانتي گراد نگهداري شد.
3-9 منشا سلولي مورد استفاده:
سلول هاي Hela از سلول هاي سرطاني رحم انسان مي باشد. از ويژگي اين سلول تحمل تعداد پاساژ هاي زياد و قدرت تکثير بالا مي باشد و براي تکثير ويروس هايي نظير هرپس سيمپلکس، روتا ويروس و … سلول مناسبي مي باشد. سلول مورد استفاده در اين تحقيق از بانک سلولي انستيتوپاستور ايران تهيه گرديد.
3-10 تهيه کشت سلولي Hela :
در اين پژوهش از سلول Hela جهت تکثير HSV-1 استفاده گرديد. براي کشت اين سلول ها از فلاسک هاي پلاستيکي يکبار مصرف مخصوص کشت سلول با سطح 25 سانتي متر مربع استفاده شد. تعداد 105 سلول به ازاء هر ميلي ليتر از محيط کشت در نظر گرفته شد. بدين ترتيب براي فلاسک 25 سانتي متر مربعي که به
5 ميلي ليتر محيط کشت نياز دارد 105× 5 سلول اضافه شد. سلول هاي Hela را در فلاسک مخصوص کشت سلول به همراه محيط DMEM که به آن 10% سرم جنين گاو اضافه شده بود کشت داده و در انکوباتور CO2 دار در 37 درجه سانتي گراد نگهداري شدند. اين سلول ها با تکثير پياپي سطح فلاسک را پر کرده و يک منولاير کامل را تشکيل دادند.
3-11 حفظ و نگهداري سلول ها:
به منظور محافظت از کشت سلول روش هاي متفاوتي وجود دارد. يکي از آنها نگهداري سلول در ازت مايع يا در فريزر 70- درجه سانتي گراد در مجاورتDMSO مخصوص کشت سلول و سرم جنين گاوي ميباشد وجود DMSO مانع از ليز شدن سلول ها در دماي پايين مي شود و روش ديگر پاساژ سلول ها در مواقع لزوم مي باشد.
3-12 پاساژ سلول:
در مورد سلول Hela پس از پر شدن کامل سطح فلاسک کشت سلول و تشکيل منولاير کامل از سلول، در زير هود بيولوژيک محيط را خارج کرده و به وسيله PBS استريل سلول ها را شستشو داده، سپس از تريپسين براي جدا شدن سلول ها از سطح فلاسک استفاده شد. بلافاصله بعد از آغاز جدا شدن سلول ها از سطح فلاسک، تريپسين را خارج کرده و با افزودن محيط کشت سلول و عمل پيپت کردن سلول ها، سوسپانسيون يکنواختي از آنها در محيط کشت بدست آمد. بعد از يکنواخت شدن سوسپانسيون سلولي 200 ميکروليتر از سوسپانسيون فوق را براي شمارش سلولي در داخل لوله استريل قرار داده و بقيه در فلاسک مناسب کشت سلول انتقال داده شد. جهت دستيابي به کشت سلول مناسب لازم است تا در هر ميلي ليتر سوسپانسيون سلولي105 × 2-1سلول وجود داشته باشد. سلول هاي Hela را مي توان به راحتي با اضافه کردن بخشي از محيط DMEM حاوي 10 درصد سرم تعويض محيط نمود.
3-13 تکثير HSV-1 سويه KOS در سلول Hela:
در اين تحقيق از ويروس هرپس سيمپلکس سويه KOS استفاده شد. ويروس فوق از دپارتمان ويروس شناسي دانشگاه تربيت مدرس تهيه گرديد. پس از آنکه سلول هاي Hela حدود 85% از سطح فلاسک را پوشاندند، محيط کشت از سطح سلول ها خارج گرديد و سلول ها با محلول PBS مورد شستشو قرار گرفتند. به سلول هاي موجود در فلاسک، 500 ميکروليتر از تعليقHSV-1 تلقيح شد. فلاسک به آرامي تکان داده شد تا تمامي سطح سلول ها به سوسپانسيون ويروسي آغشته شود. براي کامل شدن جذب ويروسي درب فلاسک را بسته و به مدت 1 ساعت در انکوباتور قرار داده شد و هر 10 دقيقه فلاسک ها به آرامي تکان داده شدند تا جذب سلول بطور يکنواخت صورت گيرد. پس از اتمام زمان جذب، سلول ها مجددا با PBS شستشو داده شدند و سپس محيط کشت DMEM حاوي 2% سرم جنين گاوي به سلول هاي فوق اضافه گرديد و به مدت 48 تا 72 ساعت تا ظهور آثار (CPE) Cytopathic Effect در انکوباتور 37 درجه سانتي گراد نگهداري شد. پس از سپري شدن اين مدت با مشاهده 80 درصد CPE در منولاير سلولي، فلاسک به فريزر 70- درجه سانتي گراد انتقال داده شد.
3-14 تعيين عيار ويروس به روش TCID50 :
قبل از استفاده از ويروس بايد عيار آن مشخص گردد. بدين منظور از روش TCID50( Tissue Culture Infective Dose 50) استفاده مي شود. اساس اين روش اندازگيري رقتي از تعليق ويروسي است که بتواند 50 درصد از کشت هاي سلولي تلقيح شده را آلوده کند. عيار ويروس به صورت دوز عفوني 50 درصد يا TCID50 بيان مي شود.
در اين تحقيق جهت تعيين تيتر ويروس ها از روش فوق استفاده گرديد.
روش کار:
براي تعيين عيار ويروس مورد مطالعه از رقت هاي ويروسي با فواصل لگاريتمي 1 استفاده شد.
براي تهيه رقت هاي با فواصل 1 log، از مخلوط 8/1 ميلي ليتر DMEM بدون سرم به عنوان رقيق کننده و مقدار 2/0 ميلي ليتر ويروس استفاده مي شود و بدين ترتيب رقت هايي از 10-1تا 10-9از ويروس تهيه گرديد.
از هر رقت 100 ميکروليتر به 4 خانه از چاهک هاي ميکروپليت (96 خانه اي) حاوي سلول از قبل آماده شده تلقيح شد.
در هر ميکروپليت 4 چاهک بدون تلقيح ويروس به عنوان شاهد سلول و 4 چاهک با تلقيح ويروس رقيق نشده به عنوان شاهد ويروس در نظر گرفته شد.
ميکروپليت به مدت 1 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتي گراد انکوبه گرديد تا ويروس جذب سلول ها شود.
به هر چاهک 150 ميکروليتر محيطDMEM حاوي 1% سرم افزوده شد و به انکوباتور 37 درجه سانتي گراد انتقال يافت.
ميکرو پليت واجد سلول آلوده هر روز از نظر CPE کنترل شد و براي هر رقت از ويروس نسبت تعداد چاهک ها از هر رقت که CPE نشان داده اند به کل چاهک هايي که به يک رقت اختصاص داده شده اند در نظر گرفته شد.
CPE تشکيل شده در هر چاهک به صورت 0 و 1 در نظر گرفته شد که هر کدام از اين عدد ها به صورت زير تعريف

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *