منابع مقاله درمورد افراد مبتلا

(29).
کواک و همکاران در سال 2008: نشان دادند که جهش در ناحيه آلل G/A (rs242557) باعث افزايش بيان ژن MAPT و ساختار غيرطبيعي آن ميشوند. در نتيجه به جاي ميکروتوبولها به ميکروفيلامنتها متصل ميگردد و اين موجب بيماري آلزايمر ميگردد. همچنين نويسنده اشاره دارد به اين موضوع که هاپلوتايپهاي H1/H2 از ژن MAPT با عملکرد پلي مورفيسمهاي موجود در ژن GSK3B و افزايش ريسک ابتلا به آلزايمر در ارتباط است(24).
ليو و همکاران در سال2013: در اين مطالعه ارتباط پلي مورفيسم ( rs 242557) در ژن MAPT با بيماري آلزايمر ديررس بررسي شده است و ارتباط معناداري بين اين پلي مورفيسم و بيماري آلزايمر وجود داشته و به عنوان يک ريسک فاکتور براي بيماري آلزايمر ديررس معرفي شده است (25).
جديدترين مطالعه در زمينه ارتباط اين پلي مورفيسم با بيماري آلزايمر ، در سال 2014 صورت گرفته است و در آن حجم نمونهاي به تعداد 141 نفر بيمار و 179 نفر کنترل (شاهد ) شرکت کننده مورد بررسي قرار گرفتند و پس از انجام آناليزهاي آماري لازم ارتباط معنادار اين پلي مورفيسم با بيماري آلزايمر ديررس شناخته شد (02/0 Pvalue?)
فصل سوم:
مواد و روشها
1-3: روش شناسي تحقيق
1-1-3 : نوع مطالعه
روش تحقيق توصيفي مقطعي از نوعCase-serries مي باشد و با توجه به اينکه دسترسي به بيماران آلزايمري قطعي مشکل بوده و نيز تغييرات مورد بررسي MAF(Minimum Allele frequency) مشخص در جمعيت ايراني ندارند لذا نهايتا تحقيق به صورت Case Serries صورت پذيرفته و حداقل امکان موجود و جامعه در دسترس 50 بيمار تعيين گرديده است که امکان دسترسي داشته باشد..
2-1-3 : جامعه آماري
بيماران مبتلا به آلزايمر، بستري در مرکز نگهداري ( نورسته) و ساير مراکز همکار مورد ارزيابي اوليه قرار گرفته و پس از بيماري يابي و تائيد بيماري توسط متخصص اعصاب و روان، مشاوره و ثبت اطلاعات پرسشنامه طرح تحقيقاتي از طريق مصاحبه با خانواده بيمار و مطالعه پروندهي بيمار انجام يافته و افراد کانديد براي بررسي انتخاب ميگردند که پس از کسب رضايت اولياء و همراهان با نمونهگيري از افراد مبتلا و در صورت امكان خانوادهي آنان به ميزان cc 5 خون حاوي ماده ضد انعقاد EDTA، استخراج DNA صورت پذيرفته و با استفاده از دستگاه نانودراپ كيفيت سنجي نمونهها انجام پذيرفته و از هر بيمار حداقل 100 ميکروليتر DNA تهيه گرديده و جهت بررسي مولکولي استفاده ميگردد
3-1- 3: معيار DSM-?
DSM ،در واقع کتابي است که اولين بار در سال 1952 توسط Psychiatric Association American به عنوان معياري براي تشخيص ناهنجاريهاي ذهني به چاپ رسيد و ناهنجاري هاي جديد به تدريج به آن افزوده شد . آخرين نسخه اين کتاب ، در سال 1994 به چاپ رسيد که در ايالات متحده و بسياري از نقاط جهان توسط پزشگان و محققين ، به عنوان يک معيار تشخيصي مورد استفاده قرار ميگيرد. DSM-? تنها به عنوان معيار تشخيصي پس از معاينه مورد استفاده قرار ميگيرد و فاقد راهنمايي جهت نحوه معاينه و يا درمان است. يکي از کاربردهاي اين معيار ، در اهداف تحقيقي است. در مطالعات متمرکز بر يک بيماري خاص، افرادي که داراي علائمي مطابق با معيارهاي . DSM-? براي آن بيماري خاص ، هستند به عنوان بيمار وارد مطالعه ميشوند.
معيارهاي . DSM-? براي تشخيص زوال عقل از نوع آلزايمر :
الف- بروز نقصهاي شناختي که عبارتند از :
1- نقص در حافظه که به صورت نقص در يادگيري اطلاعات جديد و يا يادآوري اطلاعات ياد گرفته شده قبلي است .
2-يک يا دو نقص شناختي مانند : عدم توانايي در سخن گفتن81 ، عدم تشخيص افراد و اشياء با وجود سالم بودن حواس82 و عدم انجام فعاليتهاي حرکتي با وجود سيستم حرکتي سالم 83
ب- نقصهاي شناختي مذکور در الف-1 و الف-2 ، باعث نقصانهاي قابل توجهي در عملکرد شغلي و اجتماعي فرد و تنزل او از جايگاه قبلش مي گردد.
پ -بيماري آغاز تدريجي داشته و تا تنزل شناختي ادامه مي يابد.
ت- نقصهاي مذکور در الف-1 و الف-2 به واسطه عوامل زير نيستند :
1- شرايطي از سيستم عصبي مرکزي که سيبب نقص پيشرونده در حافظه و شناخت ميشوند مانند بيماري هاي مغزي عروقي ، پارکينسون ،هماتوم زير سخت شامه ، زوال عقلي ناشي از هيدروسفالي و تومور مغزي .
– شرايط سيستميک که از عوامل ايجاد زوال عقل به شمار ميآيد مانند : کم کاري تيروئيد ، کمبود ويتامين B يا اسيد فوليک ، کمبود نياسين ، کلسيم بالا ، سيفيلين سيستم عصبي مرکزي و عفونت HIV .
3-شرايط القايي توسط يک ماده خاص .
ث-نقصانها منحصرا در يک دوران روان آشفتگي رخ نميدهد.
4-1-3 : معيارهاي انتخاب بيماران
تشخيص بيماري با معيار DSM-? ،سن بالاي 65 سال و امضاي فرم رضايت نامه توسط بيمار يا قيم وي به عنوان معيار ورود مطالعه محسوب ميشدند. سن کمتر از 65 سال ، وجود هر گونه بيماري نورولوژيک يا روانپزشکي همراه ،وجود سابقه خانوادگي و عدم تمايل به همکاري از طرف بيمار و يا قيم وي به عنوان معيار خروج براي انتخاب بيماران در نظر گرفته شدند.
5-1-3: روش جمع آوري دادهها
اطلاعات افراد حاضر در مطالعه از طريق مراجعه حضوري به مراکز ذکر شده ، گردآوري شد.بخشي از دادهها از طريق مصاحبه با افراد يا پرسنل شاغل در مراکز و بخشي نيز از پرونده آنها بدست آمد. دادههاي حاصل از آزمونهاي مولکولي نيز در فرم جمع آوري اطلاعات ثبت شد.
5-1-3: تعريف عملياتي متغيرها و مقياس اندازهگيري
مقياس
روش اندازه گيري
تعريف علمي – عملي
متغير کيفي
متغير کمي
نوع متغير
ا سمي رتبه اي
پيوسته گسسته
مستقل وابسته
بلي خير
معاينه پزشک
معيار DSM
(
(
ابتلا به آلزايمر
مثبت منفي
Tetra ARMS-PCR
ژن MAPT
پلي مورفيسم (rs242557)در ژن MAPT
6-1-3: ملاحظات اخلاقي
از آنجا که اين مطالعه نيازمند گرفتن نمونه خون و اخذ برخي اطلاعات از افراد بود، فرم رضايت نامه براي حاضرين در مطالعه تهيه شد و در مورد بيماران ، اين فرم به امضاي قيم آنها و در گروه شاهد، به امضاي خود فرد رسيد. اطلاعات افراد به صورت محرمانه بوده و نتايج بدون ذکر مشخصات خواهد بود.
2-3: روش اجرا
1-2-3 : استخراج DNA
روشهاي متعددي براي استخراج DNA وجود دارد. که در اين تحقيق با توجه به کميت وکيفيت مناسبDNA حاصله براي انجام PCR و همچنين نسبتاً بي ضرر بودن محلولهاي مورد استفاده در اين روشها، DNAبيمار ان را از روش نمک اشباع شده و کلروفرم استخراج نموديم.
استخراج DNA با استفاده از روش نمک اشباع:
مواد و تجهيزات مورد استفاده براي انجام استخراج DNA به روش نمک اشباع
مواد لازم:
* ايزوپروپانول 100 درصد
* پروتئيناز K 02.0 درصد
* بافر Tris-EDTA-NaCl
* سديم دو دسيل سولفات (SDS) 10درصد
* کلريد سديم اشباع (6مولار)
* اتانول 70 درصد(merck)
* آب مقطر
تجهيزات لازم:
* ميکروتيوپ با حجم 5/1ميکروليتر
* سانتريفيوژ با حداکثردور 14000 (اپندروف)
* هات پليت (زيماژن-ايران)
* بنماري (محصول شرکت بهداد)
* ميکروفيوژ ورتکس (mxcell)
* هود لامينار کلاس 2 يا هود PCR يا PCR Work Station(زيماژن)
* سمپلرهاي متغير از10 تا 1000 ميکروليتر(socorex)
* سر سمپلر هاي کريستالي، زرد و آبي رنگ
* دستکشهاي لاتکس
* رک سر سمپلر
* روپوش
* پارافيلم
تهيه محلولهاي مورد نياز
بافر )8-5/7 TES (Tris-EDTA-Salt, pH;
براي تهيه اين بافر ابتدا محلولهاي زير تهيه شدکه در زيرتوضيح هرکدام ازآنها آمده است:
) 8-4/7 Tris-HC1(1M,PH:
121/14گرم از Tris-HCl را در داخل آب مقطر حل کرده و سپس تنظيم ph با HCl صورت گرفت.
EDTA: (0/5M , PH:8)
1/186 گرم دي سديم اتيلن دي آمين تترااستات را که در ساختمانش حاوي 2مولکول آب است در ml800 آب مقطر ريخته و روي همزن مغناطيسي قرار داده سپس ph محلول را با استفاده از NaOH به 8 رسانده، پس از حل شدن، حجم محلول با آب مقطر به يک ليتر رسيد . در نهايت محلول به دست آمده به کمک فيلتر ميلي پور µm 2/0در زير هود فيلتر شده و در حجمهاي کوچک تقسيم و در يخچال نگه داري شد.
NaCl(5M)
2/292گرم NaCl در ml 800 آب مقطر حل شده و سپس حجم نهايي محلول به يک ليتر رسيد.
جهت تهيه بافر Tris-EDTA-NaCl مقادير 10 ميلي ليترHCl-Trisr 1مولار، 30 ميلي ليتر EDTA5 مولار و 30 ميلي ليتر NaCl5 مولار را مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم 100 ميلي ليتر رسانده شد و سپس محلول مورد نظر به کمک فيلترميلي پور استريل شد و با اسيد به 5/7 pH= رسانده مي شود.
SDS (10درصد)
100گرم SDS در ml900 آب مقطر حل شده و تا 68°c گرم شد. Ph محلول با استفاده از HC به 7/7 و حجم محلول با آب مقطر به يک ليتر رسيد.
TE (1X, pH:8) بافر
ML 10 از M) 5 Tris-HCl ()را با ml2 از M) 5/0EDTA () مخلوط کرده و حجم نهايي محلول با آب مقطر استريل به 1 ليتر رسانده شد و سپس به کمک فيلترميلي پور استريل شد.
روش کار
(1) به مقدار 500 ميکروليتر از خون حاوي EDTA، به مدت 10 دقيقه در 8000 دور در دقيقه84 سانتريفيوژ شد تا سرم آن جدا گردد. (خون کهنه و فريز شده به دليل ليز شدن نيازي به جداسازي سرم ندارد). سپس اين سرم حذف گشت.
(2) جهت ليز کرن گلبولهاي قرمز خون، به ميزان 1000 ميکروليتر آب مقطر سرد به رسوب سلولي افزوده و پليت سلولي در آن حل گرديد. اين عمل باعث ميشود که گلبولهاي قرمزو سفيد بترکند و هستهها بيرون بريزند.
(3) انجام مراحل 1 و 2، تا سه مرتبه تکرار شد تا لايه سلولي با رنگ صورتي شفاف حاصل گردد که به معناي حذف کامل گلبولهاي قرمز مي باشد.
(4) سپس 500 ميکروليتر(TES)Tris-EDTA-salt اضافه و کاملا مخلوط گرديد. در اين مرحله گلبول هاي سفيد ليز شده و رسوب به دست آمده کاملا به حالت محلول در ميآيد.
(5) به محلول فوق 50 ميکروليتر محلول سديم دو دسيل سولفات85(10 درصد) افزوده شد و بعد از اضافه کردن 10 ميکروليتر پروتئيناز K (02/0درصد) و بعد از اينورت کردن ملايم اين مخلوط، درب ميکروتيوپ ها با پارافيلم بسته شد و سپس بين 4تا 24ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد در داخل بنماري قرار داده شد.
(6) پس از خروج ميکروتيوپها از بن ماري، به ميزان يک سوم حجم موجود (150ميکروليتر) محلول کلريد سديم (NaCl) اشباع به آن افزوده شد تا رنگ آن کدر شود. در صورت عدم تغيير بايد ميزان NaCl را بيشتر کرد. عمل NaCl، کمک به رسوب پروتئينهاست.
نکته: معمولا اولين حجم 250 ميکروليتر خواهد بود که در اکثر موارد بعد از کمي تامل کدر ميشود. در صورت نياز هر بار به ميزان 10 ميکروليتر اضافه ميگردد. چرا که، مقادير اضافي NaCl در محيط، به عنوان مهار کننده PCR عمل مي کند . (7) پس از سانتريفيوژ در 8000 دور در دقيقه به مدت 20 دقيقه، محلول رويي به يک لوله ي تميز و استريل انتقال داده شد و به ميزان حداقل 7/0حجم محلول (حدودا 500 ميکروليتر) به آن ايزوپروپانل افزوده شد تا کلاف DNA ظاهر شود.
نکته: در مواردي که کلاف ديده نميشود ميتوان محلول الکل و DNA را براي يک ساعت در فريزر قرار داد تا کريستاله شدن تسريع گردد.
(8) مجددا ميکروتيوپها در 8000 دور در دقيقه و به مدت 30 ثانيه تحت سانتريفيوژ قرار گرفتند و سپس مايع رويي حذف گرديد.
(9) با هدف شستشو، 100 ميکروليتر اتانول 70درصد به رسوب فوق افزوده شد و سانتريفيوژ گرديد. اين مرحله، جهت حذف نمکهاي باقي مانده، که مانع PCR هستند، 3 مرتبه تکرار ميشود .
(10) سپس، درب ميکروتيوب باز گذاشته شد تا الکل باقيمانده تبخير شود.
ميتوان از ترموبلاک با دماي 37درجه

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *