منابع و ماخذ پایان نامه ويروس، پليت، گرديد.

شدند:
0: عدم حضور CPE در چاهک.
1: حضور CPE در چاهک.
قرائت نتايج تا روز سوم ادامه داشت.
از رابطه Reed & Muntch با فرمول زير براي تعيين عيار ويروس استفاده شد:
Log TCID50 = (log Dilution above 50%) + (proportinate distance × log Dilution factor)
3-15 عصاره گياه مرزه:
در اين تحقيق از گياه satureja mutica L. استفاده شد بدين ترتيب که پس از تشخيص و تعيين گونه گياه توسط کارشناسان موسسه تحقيقات جنگلها و مراتع کشور (برگهاي گياه) جدا و خشک گرديد و سپس برگهاي خشک شده آسياب گرديد و جهت استخراج عصاره آماده شد. بررسي عصاره گيري ابتدا پودر آسياب شده گياه از الکهاي 500 ميکروني عبور داده شد و سپس مقداري از پودر الک شده به ظرف شيشه اي تيره، انتقال داده شد و سپس عصاره گيري به روش خوابانيدن و با استفاده از حلال هيدروالکلي (مخلوط آب و متانول) صورت گرفت. بدين ترتيب که مقدار مشخصي از پودر آسياب شده گياه وزن شد ( 27/20 گرم) و به آن مقدار(50 ميلي ليتر) حلال که عبارت از مخلوط آب و متانول (80 درصد الکل و 20 درصد آب) بود، اضافه گرديد و پس از گذشت چند ساعت عصاره توسط کاغذ، فيلتر شد و سپس با همان حلال به حجم (50 ميلي ليتر) رسانده شد. در مرحله بعد حجم مشخصي از عصاره (20 ميلي ليتر) در حرارت 37 درجه سانتي گراد خشک شد و پودر مربوطه به دقت وزن گرديد و مقدار 5 ميلي ليتر از محيط کشت DMEM که يک محيط کشت با پايه آبي مي باشد به آن اضافه گرديد و بعد از مخلوط کردن به مدت 24 ساعت در دماي 4 درجه يخچال قرار داده شد تا عصاره فوق کاملاً در محيط حل گردد. در مرحله بعدي اين مايع از فيلتر 22/0ميکرون عبور داده شد و بدين ترتيب وزن مشخصي از عصاره گياهي در حجم مشخصي از محيط کشت بدست آمد و براي مراحل بعدي کار، غلظت هاي مختلف از عصاره از اين ترکيب بدست آمده و مورد استفاده قرار گرفت.
3-16 اندازه گيري آستانه سميت عصاره بر سلول:
در ابتدا لازم بود که سميت عصاره مرزه بر سلول هاي Hela بدون حضور ويروس تعيين گردد.
اين عمل به منظور يافتن حد اکثر دوز غير توکسيک عصاره براي سلول، با دو متد رنگ آميزي حياتي تريپان بلو و MTT assay انجام شد.
3-16-1 روش تريپان بلو:
اين روش براي شمارش و تعيين نسبت سلول هاي مرده و زنده استفاده مي شود. تريپان بلو يک رنگ حياتي مي باشد که سلول هاي زنده رنگ را نپذيرفته و بدون رنگ باقي مي مانند اما سلول هاي مرده چنين قابليتي را نداشته و در نتيجه رنگ را پذيرفته و به رنگ آبي مشاهده مي شوند.
روش کار:
1- در دو پليت 24 حفره اي کشت سلول Hela انجام شد تا منولاير سلولي تشکيل گردد.
2- پس از تخليه محيط هر چاهک، سلول ها دو بار توسط PBS شسته شدند.
3- رقت مختلف از عصاره گياهي مورد نظر از محلول استوک در محيط کشت DMEM حاوي 2 درصد سرم تهيه شد (در لوله هاي استريل) از هر رقت 5/0 ميلي ليتر در هر حفره اضافه شد (براي هر رقت، 4 چاهک در نظر گرفته شد).
4- چاهک نيز به عنوان کنترل سلول در نظر گرفته شد که به آن محيط DMEM حاوي 2% سرم اضافه گرديد.
از هر رقت در فواصل زماني 24، 48، 72، 96 ساعت يک چاهک براي رنگ آميزي انتخاب شده و محيط رويي سلول ها به يک ميکروتيوب منتقل شد. با اين کار اگر در طي انکوباسيون سلول مرده اي از کف فلاسک جدا شده باشد در مايع رويي وجود داشته و در بررسي هاي بعدي در نظر گرفته مي شد.
سلول ها با 500 ميکروليتر PBS شسته شده و PBS به داخل ميکروتيوب ذکر شده منتقل گرديد.
به هر چاهک 200 ميکروليتر تريپسين اضافه و به آرامي تکان داده شد تا تمام سطح سلول ها را پوشش داده و سپس درب پليت بسته و در انکوباتور 37 درجه سانتي گراد به مدت 2 دقيقه انکوبه گرديد.
تريپسين خارج شده، به هر چاهک 5/0 ميلي ليتر PBS اضافه شد و سپس سلول ها به طريق پيپت کردن از کف چاهک کنده شده و سوسپانسيون سلولي فوق به ميکروتيوب قبلي (حاوي محيط رويي کشت اوليه) انتقال داده شد.
ميکروتيوب فوق در سانتريفوژ با دور 1500 و زمان 5 دقيقه قرار گرفت تا سلول ها در ته ميکروتيوب رسوب نمايند.
10- محيط رويي سلول ها خارج شده و به آن 100 ميکروليتر PBS و 50 ميکروليتر رنگ حياتي تريپان بلو اضافه و به آرامي با سمپلر مخلوط شده تا سوسپانسيون يکنواخت بدست آيد.
11- سلول ها توسط لام نئوبار شمارش شده و درصد سلول هاي زنده با فرمول زير يه دست آمد.
زنده هاي سلول درصد=((رنگ بدون)زنده هاي سلول تعداد)/((رنگ آبي و رنگ بدون)وزنده مرده هاي سلول کل تعداد)×100
3-16-2 روش MTT assay :
تست MTT روشي براي تعيين زنده بودن (viability) سلول ها است. تمام مراحل آزمايش از ابتداي کشت سلول Hela تا قرائت با فتومتر در يک ميکروپليت 96 خانه اي انجام شد. سوبستراي واکنش، نمکهاي محلول تترازوليوم مي باشند، که مهمترين آنها نمک (MTT)
3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)5-diphenyl-terazolium bromide است. نمک MTT توسط سيستم سوکسينات تترازوليوم ردوکتاز که يکي از آنزيم هاي چرخه تنفسي در ميتوکندري است و فقط در سلول هاي زنده يافت مي شود، شکسته شده و منجربه تشکيل ماده نامحلول (فورمازان) شده و در طي آزمايش با تعداد سلول هايي که از نظر متابوليک فعال هستند رابطه مستقيم دارد، فورمازان در آب نامحلول بوده و به صورت کريستال هايي با ميکروسکوپ معمولي قابل مشاهده هستند و با استفاده از حلال هايي چون ايزوپروپانول اسيدي و يا DMSO حل شده و به ترکيب رنگي تبديل مي شود و ترکيب رنگي فوق مورد رنگ سنجي قرار مي گيرد.
بدين ترتيب ميزان جذب نوري حاصل از رنگ ايجاد شده مربوط به سلول هاي در معرض عصاره و همچنين مربوط به سلول هاي کنترل با استفاده از دستگاه الايزا Reader در طول موج 540 نانومتر اندازه گيري شده و نسبت جذب نوري سلول هاي در معرض عصاره به سلول هاي کنترل محاسبه مي گردد و عدد بدست آمده از نسبت فوق در عدد 100 ضرب شده و بدين ترتيب درصد سلول هاي زنده در سلول هاي هر چاهک مشخص مي گردد.
روش انجام تست MTT:
مراحل اين تست به شرح زير انجام شد:
فلاسک حاوي منولاير سلول Hela را با PBS شستشو داده و به سلول ها محلول تريپسين اضافه شد و به محض گرد شدن سلول ها تريپسين از فلاسک خارج گرديد.
سلول ها با 2ميلي ليتر محيط DMEM بدون سرم و با عمل پيپت کردن به صورت يک سوسپانسيون سلولي يکنواخت تبديل شد.
100 ميکروليتر از سوسپانسيون سلولي برداشته شده و براي بدست آوردن تعداد کل سلول ها در داخل يک ميکروتيوب ريخته و توسط لام نئوبار شمارش شد.
تعداد يک پليت 96 خانه اي در نظر گرفته شد و در هر چاهک از پليت 96 خانه اي، تعداد 10000 سلول در 200 ميکروليتر محيط DMEM حاوي 10% سرم کشت داده شد .
پس از 48 ساعت از انکوباسيون و تشکيل منولاير سلولي در چاهک ها 3 رقت از عصاره ي گياه مورد آزمايش همراه با 2% سرم به سلول هاي هر چاهک اضافه شد. براي هر رقت 3 چاهک از پليت 96 خانه اي در نظر گرفته شد و 3 چاهک نيز بعنوان کنترل سلول در نظر گرفته شد.
پس از گذشت 96 ساعت در پليت 96 خانه اي سلول ها را با PBS شستشو داده و به سلول هاي هر چاهک 20 ميکرو ليتر محلول MTT و 80 ميکروليتر محيط DMEM اضافه شد (محلول MTT با اضافه کردن 005/0 گرم از پودر MTT به يک ميلي ليتر محلول PBS تهيه گرديد).
پس از 4 ساعت انکوباسيون در دماي 30 درجه سانتي گراد و تشکيل کريستال هاي فورمازان، محيط رويي به آرامي خارج و به هر چاهک 100 ميکروليتر DMSO براي حل شدن کريستال ها اضافه شد.
پليت به مدت 15 دقيقه Shake گرديد.
ميزان جذب هر چاهک در طول موج 540 nm اندازه گيري و ثبت گرديد.
ميانگين OD مربوط به هر 3 چاهک که اختصاص به يک رقت خاص داشت محاسبه گرديد.
ميانگين OD مربوط به 3 چاهک که بعنوان کنترل در نظر گرفته شده بود نيز محاسبه شد.
با تعيين نسبت ميانگين OD مربوط به هر رقت به ميانگين OD چاهک هاي کنترل و ضرب عدد حاصل در عدد 100، درصد سلول هاي زنده مربوط به هر رقت بدست آمد.
3-17 تاثير مستقيم عصاره بر ويروس HSV1:
در اين مرحله به بررسي خواص ضد ويروسي عصاره گياهي به طريق تاثير مستقيم عصاره بر روي ويروس خارج از سلول پرداخته شد. براي اين کار در زمان هاي مختلف 0 ، 1، 2، 3 و 4 ساعت، بالاترين غلظتي از عصاره گياهي که فاقد سميت براي سلول Hela بود با مقدار مشخصي ويروس هرپس سيمپلکس تيپ يک ( 100 TCID50 ) مجاور شده و در دماي 4 درجه سانتي گراد قرار داده شد و پس از گذشت زمان هاي فوق، از آن مقدار مشخصي برداشت و به جهت مشخص کردن ميزان کاهش عفونت زايي ويروس به سلول هاي Hela در چاهک هاي پليت 24 خانه اي تلقيح شد و بعد از 48 ساعت از مايع رويي از کشت سلولي فوق نمونه برداري و تيتر ويروس هر چاهک به طور جداگانه به روش TCID50 مشخص گرديد. در موازات اين کار از همان مقدار ويروسي که در بالا اشاره شد (100 TCID50) ويروس در محيط DMEM فاقد عصاره تهيه شد و مشابه تست فوق در زمان هاي مورد اشاره به سلول هاي Hela در چاهک هاي پليت 24 خانه اي تلقيح شد و بعد از 48 ساعت از مايع رويي از کشت فوق نيز نمونه برداري و تيتر ويروسي مشخص گرديد. اين کار به جهت کنترل ويروس صورت گرفت تا کاهش تيتر ويروس در دماي 4 درجه سانتي گراد در شرايط بدون عصاره گياهي مورد سنجش قرار گيرد.
روش کار:
در 2 ميلي ليتر محيط DMEM حاوي بالاترين غلظت غير توکسيک عصاره، مقدار 100 TCID50 سوسپانسيون ويروسي تهيه شد.
در زمان هاي مختلف ( 0، 1، 2، 3 و 4 ساعت) چاهک هاي پليت 24 خانه اي را شسته و 200 ميکروليتر سوسپانسيون ويروسي فوق تلقيح گرديد. (در طي اين مدت سوسپانسيون ويروسي در دماي 4 درجه سانتي گراد نگهداري شد) پس از تلقيح سوسپانسيون ويروس، پليت 24 خانه اي جهت جذب ويروسي به انکوباتور 37 درجه سانتي گراد منتقل گرديد.
پس از يک ساعت جذب ويروسي محيط رويي سلول خالي و سلول ها شسته شد و به ميزان1000 ميکروليتر محيط DMEM حاوي 2% سرم افزوده شد. ( مشابه همين کار در محيط DMEM فاقد عصاره گياهي به عنوان کنترل نيز انجام شد).
بعد از 48 ساعت از مايع رويي کشت هر چاهک مورد آزمايش نمونه برداري شد و تيتر ويروسي در پليت 96 خانه اي حاوي منولاير سلولي Hela به روش TCID50 تعيين تيتر گرديد.
3-18 اثر مهارکنندگي عصاره در غلظت هاي مختلف بر تکثيرHSV-1 :
اين عمل به منظور بررسي اثر عصاره در غلظت غير توکسيک و غلظت پايين تر از آن بر ويروس جذب شده در سلول انجام شد تا تاثير غلظت هاي مختلف عصاره در تکثير ويروس مشخص گردد.
روش کار:
ابتدا يک پليت 24 خانه اي حاوي منولاير يکنواخت سلولي فراهم گرديد.
4 رقت پايين تر از غلظت غير توکسيک عصاره در محيط DMEM حاوي 2% سرم آماده شد.
5 چاهک از پليت با 100 TCID50 ويروس تلقيح شد.
پس از يک ساعت جذب ويروس به سلول، به 4 چاهک از چاهک هاي آلوده به ويروس، 4 رقت عصاره و به يک چاهک فقط محيط DMEM حاوي 2 % سرم (براي کنترل ويروس) به ميزان1000 ميکروليتر اضافه شد.
پس از 48 ساعت از هر چاهک براي تعيين عيار ويروس نمونه برداري انجام گرديد.
در پليت 96 خانه اي حاوي منولاير سلول Hela، تيتر ويروس به روش TCID50 به روي هر نمونه بطور جداگانه مورد سنجش قرار گرفت.
3-19 بررسي اثر ضد ويروسي عصاره بر مراحل مختلف همانند سازي HSV-1:
در اين پژوهش جهت مشخص شدن زمان اثر بخشي عصاره بر همانند سازي ويروس و اينکه جلوگيري از تکثير ويروس در چه مرحله اي تحقق مي يابد، به ترتيب زير عمل شد. لازم به ذکر است، براي اين کار از بالاترين غلظت غير توکسيک عصاره استفاده شد:
در يک پليت 24 خانه اي منولاير سلولي Hela فراهم شد.
در يک چاهک از 5 ساعت قبل

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *